干扰Notch2对神经胶质瘤抑制的研究

【摘要】胶质瘤是最常见的中枢神经系统的恶性肿瘤,具有较强的侵袭性和进展性。目前临床治疗上采用的主要方法有手术切除、放疗及化疗的综合疗法,但由于胶质瘤的生长特性,与周围脑组织界限不清,手术难以切除完全,而放疗、化疗由于胶质瘤对其耐受性等治疗的局限性,疗效有限,患者中位生存期较短,尤其对于高级别胶质瘤,治疗后复发率较高,预后差,中位生存期不足一年,病死率高,严重威胁患者生命影响人类健康。研究其发病机制,寻找新的有效的治疗方法是临床研究的主要目标之一。细胞周期调控和细胞凋亡与肿瘤的发生与发展过程密切相关,在胶质瘤发生和发展过程中,存在着很多信号传导系统,复杂而精细调控机体内环境的平衡,癌基因及抑癌基因对细胞周期及细胞凋亡通路调节的失控,信号通路传导系统异常刺激肿瘤细胞增殖与进展,发生细胞癌变。在分子水平上的免疫治疗和基因治疗是近年来胶质瘤治疗研究的新方向,通过抑制异常激活的信号传导通路,调控细胞周期,是促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖的有效措施之一Notch信号通路是在无脊椎动物和脊椎动物中普遍存在的,在进化上具有高度的保守性的信号传导通路,在细胞增殖、分化、发育中具有重要的关键性作用。Notch信号通路与恶性肿瘤的关系已成为近年来的研究热点之一,其与肿瘤通路有较多的相互作用,Notch受体和配体在多种肿瘤中表现为异常表达,与多种肿瘤的发生、发展关系密切。且在不同类型的肿瘤中,甚至在同一肿瘤的不同发展阶段,Notch表达的作用也不尽相同,可表现为致癌性,也可表现为抑癌性。Notch受体包括Notchl-4种,研究显示,每种受体在肿瘤中的生物学功能有所不同,甚至截然相反,因此,有必要对每种Notch受体分别进行研究。关于Notch信号与肿瘤生成的因果关系尚无定论,在肿瘤细胞中发现Notch信号通路异常,寻找到可能的靶点,通过体外试验和动物实验等方法,靶向研究Notch信号通路异常对肿瘤生成的影响,探讨Notch信号通路和肿瘤生成的作用机制,以期对肿瘤诊断和治疗提供新的思路和方法,是研究的常用模式。RNA干扰技术是研究基因功能的有效手段,有利于迅速的发现药物作用的有效靶点,并通过体外细胞培养等实验技术来得以证实。短发夹状RNA(shRNA)是设计为能够形成发夹结构的非编码小分子RNA,可被细胞核内自身基因表达序列表达,可以通过内源性的RNA干扰来抑制特定基因的表达,可使靶向基因长时间稳定沉默。质粒载体是shRNA主要载体之一,能使目的shRNA穿过生理屏障,并在细胞核内完成自我复制发挥稳定持久的干扰效果。以质粒构建shRNA并转染细胞是肿瘤分子水平研究的重要手段之一。裸鼠是先天性胸腺缺陷的突变小鼠,是肿瘤学研究中常用的动物模型,其免疫缺失和便于观察等特点,使其在肿瘤研究中被广泛应用。近年来研究发现Notch信号在人类脑胶质瘤中也发挥作用,但Notch信号在胶质瘤的发生和发展中的具体作用尚不明确。本实验应用免疫组化方法对32例脑胶质瘤标本和20例脑组织标本进行Notch2蛋白的检测,研究Notch2在人类脑胶质瘤中的表达及意义。并构建Notch2-shRNA干扰质粒对人胶质瘤细胞株U251进行转染,建立稳定转染的细胞株,利用实时定量PCR、蛋白印迹法(westernblot),MTT法及流式细胞术(FCM)等检测各组细胞周期、细胞增殖和细胞凋亡情况。再以Notch2基因敲除的U251细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型,观察Notch2对体内肿瘤的生成和肿瘤生长的影响,为临床肿瘤治疗提供可靠的论依据。本实验共分为3个部分。第一部分Notch2蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达及意义目的：研究Notch2蛋白在人脑胶质瘤组织中的表达及临床意义。方法：选择胶质瘤标本22例和正常脑组织标本20例为研究对象,采用免疫组化法检测并比较其Notch2表达,并分析Notch2表达与胶质瘤病理分级的相关性。结果：Notch2表达在胶质瘤组织中显著高于正常脑组织中Notch2表达(P<0.001)。在Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤中Notch2的表达显著低于Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中Notch2的表达(P<0.01)。结论：Notch2与胶质瘤发生、发展密切相关,为胶质瘤的诊断和治疗提供新的思路和理论依据。第二部分Notch2-shRNA稳定转染对人脑胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡和细胞周期的影响目的：研究Notch2-shRNA稳定转染对人脑胶质瘤细胞株U251增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法：构建Notch2-shRNA干扰质粒及相同载体的无意义序列Negative-shRNA对人胶质瘤细胞株U251进行转染,建立稳定转染的细胞株,分别作为Notch2-shRNA干扰组和Negative-shRNA干扰组,并以未转染U251细胞作为未转染对照组,利用实时定量PCR、蛋白印迹法(westernblot)测定各组Notch2及相关蛋白的表达情况,采用MTT法观察各组U251细胞生长情况,采用流式细胞术(FCM)检测各组细胞周期和细胞凋亡情况。结果：与Negative-shRNA干扰组和未转染组相比,Notch2-shRNA干扰组细胞中Notch2蛋白及其活性片段NICD蛋白在Notch2-shRNA干扰组中表达显著降低,cyclinD1和MCM2蛋白在Notch2-shRNA干扰组中的表达亦明显降低,p21和p27蛋白的表达明显升高。MTT生长曲线显示,Notch2-shRNA干扰组细胞生长速度较Negative-shRNA干扰组和未转染组更慢,尤其从第5天开始,Notch2-shRNA干扰组生长速度较其他两组显著降低(均P=0.000<0.001)。Notch2-shRNA干扰组、Negative-shRNA组和未转染组的U251细胞的凋亡率分别为(13.22±1.90)%、(2.62±0.26)%和(2.47±0.36)%,Notch2-shRNA干扰组显著高于Negative-shRNA组和未转染组,差异均有统计学意义(P=0.003,P=0.003)。在G1期,Notch2-shRNA干扰组细胞百分比显著高于Negative-shRNA干扰组和未转染组(P=0.000<0.001,P=0.000<0.001,),在S期,Notch2-shRNA干扰组细胞百分比显著低于Negative-shRNA干扰组和未转染组(P=0.000<0.001,P=0.000<0.001,)。结论：Notch2与胶质瘤U251细胞增殖、凋亡及细胞周期有关,抑制Notch2表达可抑制细胞增殖,诱导细胞凋亡,使细胞周期在G1/S期被阻滞,其作用的发挥可能是通过下调cyclinD1和MCM2蛋白的表达和上调p21和p27蛋白的表达实现的。第三部分Notch2-shRNA稳定转染细胞株U251的裸鼠皮下移植研究目的：研究Notch2蛋白抑制的人胶质瘤细胞株U251的致瘤性及对裸鼠生存时间的影响。方法：以Notch2-shRNA及相同载体无意义序列Negative-shRNA稳定转染的U251细胞株、和未转染的U251细胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型,每组各10只,定期测量肿瘤大小,绘制肿瘤生长曲线；移植后60天每组随机取4只裸鼠处死,称量瘤重并计算肿瘤抑制率,免疫组化法检测肿瘤中Notch2表达水平；对各组其余裸鼠记录并比较其生存时间。结果：Notch2-shRNA转染组裸鼠肿瘤生长较Negative-shRNA转染组和未转染组更缓慢,肿瘤体积更小,至各组裸鼠接种第60d,Notch2-shRNA转染组、Negative-shRNA转染组和未转染组的肿瘤大小分别为(2.72±0.21)mm2、(9.23±0.17)mm2和(9.91±0.77)mm2,Notch2-shRNA转染组裸鼠肿瘤体积显著小于Negative-shRNA转染组和未转染组,差异均有统计学意义(P=0.000<0.001,P=0.000<0.001)。细胞接种60d后Notch2-shRNA转染组、Negative-shRNA转染组和未转染组平均瘤重分别为(0.46±0.04)g、(1.32±0.03)g和(1.35±0.11)g,Notch2-shRNA转染组瘤重显著小于Negative-shRNA转染组和未转染组,差异均有统计学意义(P=0.000<0.001,P=0.000<0.001)。Notch2-shRNA转染组抑瘤率为65.74%;Notch2-shRNA转染组Notch2表达明显小于Negative-shRNA转染组和未转染组(P<0.01)。Notch2-shRNA转染组、Negative-shRNA转染组和未转染组裸鼠生存时间分别为(114.33±9.05)d、(70.83±10.50)d和(71.67±8.82)d,Notch2-shRNA转染组裸鼠的生存时间显著长于Negative-shRNA转染组和未转染组(P<0.001)。结论：抑制Notch2表达可显著降低U251细胞的致瘤性,抑制胶质瘤生成和进展,为胶质瘤的基因治疗提供理论依据。
【作者】余惠平；
【导师】漆松涛；
【作者基本信息】南方医科大学，外科学（专业学位），2014，博士
【关键词】Notch2；胶质瘤；表达；shRNA；U251；稳定转染；增殖；凋亡；细胞周期；裸鼠；

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